脂蛋白（a）的研究进展和测定问题

    据美国国家胆固醇教育项目（NECP）的检测表明，美国人群中具患冠心病高危险因素者约有37％脂蛋白（a）[LP(a)]升高，而低危险因素的人群中只有14％ LP(a)升高。因此，需进一步了解LP(a)在心血管和其它血管病中的作用及其作用机制。但由于LP(a)的结构复杂性和颗粒大小的不同，很难建立准确测定血浆中LP(a)的免疫学方法。方法间的明显差异使各项临床研究资料难以相互比较和取得一致的临床解释。为此，美国国家心、肺、血液疾病研究所（NHLBI）组织了专题研讨，评价了LP(a)作为动脉硬化疾病的危险因素现状，明确未来的研究方向，明确LP(a)参与此过程的机制，并提出由NHLBI支持的LP(a)免疫学测定方法标准化的评价结果，本文介绍此研讨会的最近资料及对今后研究的建议。
    LP(a)是由KareBerg在1963年发现的人血浆中的特殊脂蛋白颗粒。由一个apoB-100连接一个蛋白，即apo（a）。apo（a）是高含糖的，高亲水性的多态性颗粒，其多肽键大小由基因多态性决定。临床研究发现，LP(a)升高与各种心血管病，脑血管病和早发的冠心病有关。但对其理化性质和病理作用的研究有许多困难。目前确知的是LP(a)可在血管的损伤部位沉积。对其cDNA的研究发现，它与溶解纤维蛋白的纤溶酶原具有同源性。LP(a)可以干扰纤溶酶原在纤溶过程中的作用，这为LP(a)在动脉硬化和血栓形成中的作用提供了直接证据。
    此次研讨会对LP(a)的以下重要问题进行了探讨。
    一． LP(a)的合成与代谢。人血浆中LP(a)的浓度差异很大，从0.1nmol/L至>250nmol/L，LP(a)主要在肝内合成，可能在肝细胞表面由apoB-100和apo（a）装配而成，用于合成的apoB是新合成的，而不是来自LDL中的apoB，血浆中LP(a)浓度可调节其合成的速度，apo（a）与apoB-100按1：1分子由单一的二硫键相连。一些可改变其构型的因素可以干扰apoB与apo（a）的交联。这为降低血浆中LP(a)的浓度提供可能性。
LP(a)的体内代谢过程仍未搞清，已发现血浆中apo（a）的存留期为4.8天，而apoB-100只有2.5天，说明后者的更新速度为前者的一倍。LP(a)的主要代谢部位，其受体和非受体结合过程仍待研究。
    二． 决定血浆中LP(a)浓度的基因。apo（a）颗粒大小具有明显的基因多态性。血浆中LP(a)浓度的90％以上是由LPA基因决定的；70％以上是由LPA基因的K4重复数目决定的，但对不同人种此种决定的程度可有差异。LPA基因的编码区和非编码区的序列差异可影响血浆中LP(a)的浓度，其影响程度也因人种而异。因此，对apo（a）颗粒大小和心血管病的关系应区别不同人种来对待和研究。
    三． 应用基因组研究apo（a）的基因演变和调节。经应用基因测序和基因演化树分析，发现人，猿和狒狒的apo（a）基因位点（~1.6kb）高度保守，与转录起始位点相临。此部位的最低变异区相应地含有第一个外显子，TATA基因盒和肝细胞转录因子1α结合部位。经基因序列比较，明确了纤溶酶原基因与apo（a）基因的联系，由此出现了既能结合LDL，又能结合纤维蛋白的分子，这是LP(a)促凝作用的物质基础。
    四． 用动物模型研究LP(a)的作用机制。由于LP(a)基因只存于人类（猿，狒狒），应用转基因鼠和兔两种模型均能证实LP(a)的促动脉硬化作用。早期的试验资料表明，给转apo（a）或apoB-100基因的鼠喂以促动脉硬化食物，鼠的动脉有明显损伤，出现脂肪条块，损伤处有apoB的沉积。应用转基因兔发现，动脉损伤的范围更为广泛，损伤处的病理形态学变化与人的动脉易破裂斑块处相似。
    五． 血浆中LP(a)浓度测定中的问题。由于LP(a)的K4区重复的次数不同，形成大小不同的颗粒。在免疫测定中如应用了针对不同颗粒的不同表位的单克隆抗体，必然会产生差异。理想的免疫测定方法应保证所用抗体针对相同的校准物和测定物的表位。
但目前各厂家的LP(a)测定校准物是自选的，校准物中apo（a）的颗粒大小与样本中的并不一致。有人比较了多种免疫分析中的单克隆抗体，证明只有应用LP(a)的相同要位（motif）的抗原（校准物）和单克隆抗体，其结果才能一致。因此，LP(a)的测定迫切需要标准化。实现标准化的第一步是应有一级参考物质。据此次研讨会的报告，Celina Edelstein与他人合作研制出在物理，化学和免疫学上均稳定的人血浆LP(a)，在冻干和复溶以后也不发生上述性质的改变，可望作为一级参考物。
    实现标准化的第二步是选用二级参考物质以使不同的免疫分析方法取得有可比性的结果。在IFCC的LP(a)工作组的努力下，应用冻干的人混合血清来做二级参考物，与NHLBI合作，经144次重复分析，赋值为107nmol/L。再用此参考物对各种分析方法进行准确性转移。结果22个分析系统应用IFCC的校准物对30份含不同浓度LP(a)的新鲜冰冻样本进行测定，CV值仅为2.8％表明参考物质中没有基质效应。但此30份样本的各试验室间CV达6％至31％，而且出现了因样本中LP(a)颗粒大小不同造成的差异。只有免疫浊度法对此种差异不敏感，得出极好的一致性。这表明了IFCC参考值的适用性。
尽管应用了相同的参考物，各种测定方法得到的LP(a)值仍难一致。LP(a)颗粒大小的影响之外，还有抗体性能的差异，分析方法的准确性，敏感性，样品的处理和贮存时间等因素，使不同方法间缺乏可比性。这在实现免疫法测定LP(a)的标准化中应予考虑。因此，即使有了参考方法和一级，二级参考物质也难以消除apo（a）大小差异性带来的LP(a)测定值的偏差。但WHO已接受IFCC制品，成为WHO- IFCC的LP(a)参考物质，这会对准确测定起重要作用。
    为减少apo（a）的颗粒大小不同造成的测定差异，已提出新的校准方法，此方法不用同一标准品的系列稀释物，而选用不同大小颗粒的适当浓度的校准品用于免疫浊度法的校准。初步结果表明，此法的准确性明显改善，前景乐观，但不一定适用于各种方法和条件的样本。
    六． LP(a)测定方法的不准确对测定值解释的影响。Framingham研究项目中，对2556份样本用浊度法，2662份样本用ELISA测定LP(a)，以75mmol/L即Framingham人群用参考方法测定值的75百分位数为界限值。浊度法中136份出现假阳性，23份出现假阴性。ELISA法中329份出现假阳性，25份出现假阴性。分析浊度法测定误差的原因，主要是apo（a）颗粒大小不同造成的；而ELISA法变异更大。研究发现，冰冻样本总比新鲜样本的测定值要高，高的幅度却因样本不同而异。
另一项研究（医师健康研究）分析了方法学误差对临床的影响。195名心绞痛患者与健康对照配对观察（年龄，性别，吸烟均匹配）。用参考ELISA法测定LP(a)，心绞痛组的均值比对照组高35％，且LP(a)增高与心绞痛发生的危险性有相关性。调整血脂因素后，相关性更增强。但用商品的粒子增强光散射法测定，两组的均值却无明显差异，与心绞痛的相关性也不显著。
    此两项研究明确指出，方法的适当和方法的标准化对LP(a)临床评价的重要性。
    七． LP(a)作为血管病新的危险因素的临床研究..在ATPⅢ的研究准则中LP(a)被视为心血管病（CVD）的“新出现的危险因素”。因为：
（一） 它对CVD有强的预示作用。
（二） 人群中血浆LP(a)值高于危险因素界限值者较多。
（三） 已有测定LP(a)方法和校准物，且价格不高。
（四） 减低LP(a)可减少CVD的危险性。
对27项前瞻性研究的荟萃分析，包括对5436名冠心病患者的十年跟踪观察，结果表明，人群中LP(a)浓度在高1/3百分位数者比在低1/3百分位数者，患冠心病的危险性增加约70％。
    ARIC（Atherosclerosis Risk In Comunities，社会中动脉硬化危险性研究）中，调查10年间的725例冠心病事件中，表明LP(a)具中度危险比值（RR），黑人比白人的危险性低。最近的一项联合前瞻性研究，对1216名CVD患者做6.7年随访，发现LP(a)高于300mg/L为独立的死亡因素。提出LP(a)高于300mg/L者，预后不良。
LP(a)升高与其它危险因素间的关系，如与LDLC升高，HDLC减低，蛋白C减低，有协同作用。
    八． 血浆LP(a)浓度的调节。肾脏疾患，控制不良的糖尿病患者血浆LP(a)升高。
高浓度烟酸，抗坏血酸（38％）,L-赖氨酸盐酸盐可降低血浆LP(a)浓度，不同的他汀类药物作用不同，有的可升高，新的他汀药物可降低LP(a)，阿斯匹林（81mg/日）可降低LP(a)。饮食控制，锻炼和减肥对LP(a)的影响，报告不尽一致。

    对LP(a)测定和研究的建议
    一． 为比较不同研究项目和人群的资料，临床和流行病学的LP(a)测定应准确，不受样本中apo（a）颗粒大小的影响。
    二． LP(a)测定试剂的厂家应着力于减少apo（a）颗粒大小的影响，减少不精密度及批内的抗体变化。
    三． 严格的样本采取和贮存方法，应评价冰冻样品的影响，应明确提出实验的局限性。
    四． 废止总LP(a)质量的术语，因测定的只是LP(a)的蛋白成分，并不包括脂和糖成分。为便于相互比较，单位应统一用LP(a)蛋白nmol/L。
    五． 应用IFCC的107nmol/L制品为校准品。
    六． 目前不推荐在人群中普遍进行LP(a)的筛查，但可对疑为CVD的患者，尤其是LDL-C在边缘值或有高apoB者应测定LP(a)。
    七． 据现有资料，LP(a)高于75百分位数者增加CVD的危险性。对白种人约为75nmol/L，此界限值尚需标准化的方法来确定。对非洲人种应另定界限值。
    八． 如所用的测定方法对apo（a）质粒大小敏感，测定值>50nmol/L者应送参考实验室确定，以减少临床误判的可能。
    九． apo（a）的临床研究 必须严格评估，样品量应大，应分别不同人种，还应测定apo（a）的异质体，LP(a)和apo（a）的异质体的测定方法应有文献依据。
   十． 为明确LP(a)与CVD危险性间的关系，以提供治疗策略，建议重点研究能特异地降低血浆LP(a)的药物，应进行随机的临床试验。
    十一． LP(a)促血管病的机制应继续研究，要结合应用能表达各种apo（a）变异体的转基因动物和体外实验分析。

（摘编自Marcovina SM,Koschisky ML,Alberts JJ et al. Report of Nationnal Heart,Lung and Blood Institute Workshop on lipoprotein(a) and cardiovascular disease ,recent advances and future direction.Clin Chem 2003,49(11),1785-96）

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